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论文关键词：激光扫描共聚焦显微镜；绿色荧光蛋白；碘化丙啶 microscope，CI。SM，简称共聚焦显微镜)是80年代发 展起来的，以光学为基础，融机械、电子、计算机为一体 的高精度现代化显微测试仪器，它克服了传统光学显 微镜把被观察物体一定纵深范围的结构都加以成像的 缺点，把物体分为若干光学断层，逐层扫描成像u]。 CLSM在采集样品荧光图像的基础上实现其特殊的 功能，常用于定位、定性和定量地检测生物样品中分子 和离子等成分变化、生理功能改变，对生物组织、细胞 及其亚细胞结构进行形态学观察，广泛应用于医药、材 料科学等方面[2≈]。CLSM技术已成为医药卫生学科、 生命学科学生需要掌握的一门技术。但共聚焦显微镜 操作比较复杂，学生实验课课时又短，实验经费较少， 学生理论知识又较薄弱，如何做好CLSM技术实验教 学成为生物技术专业教师面临的一个重要问题。 针对北京工业大学生命学院的实验条件、科研方 向以及学生的基础知识状况，设计了采用CI。SM观察 多重荧光标记共定位的实验教学项目。该实验以原位 观察细胞内核酸和GFP-Tetherin融合蛋白为研究对 象。Tetherin是2008年发现的具有广谱抗病毒活性 的内在抗病毒因子[4’5]。将pGFP—C3空载体或pGFP- Tetherin真核表达质粒分别转染COS-1细胞，表达 GFP或GFP—Tetherin融合蛋白，采用CLSM检测绿 色荧光蛋白的表达，并结合嵌入性荧光探针碘化丙碇 (propidium iodide，PI)标记细胞核[6]，进一步观察 GFP-Tetherin融合蛋白的亚细胞定位。本实验将 CLSM技术、细胞培养、基因克隆和荧光组织化学等 相关知识点进行有机串联，实验过程涵盖从细胞样本 处理到CLSM检测及结果分析的所有步骤，实现了 CI。SM技术理论教学与实际操作能力培养的有机 融合。 1实验材料与仪器 材料：pGFP-Tetherin或pGFP—C3质粒转染后培 养24 h的COS-1细胞、50弘g／mL PI染色液(配制方 法：PI 5 mg、RNase 2 mg、枸橼酸钠100 mg、1．0％ Triton X-100，生理盐水65 mL、加蒸馏水至100 mL)、 50 tlg／mI。RNaseA、4％甲醛固定液。 仪器：激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP2)和CO： 培养箱等。 2实验方法 2．1样本制备 取pGFP-Tetherin或pGFP—C3质粒转染后培养 24 h的COS一1细胞，弃去培养液，加入4％甲醛固定 液，室温固定30 min；弃去固定液，PBS洗涤3次．力Ⅱ 入含50／_￡g／mL RNaseA的PBS，37℃孵育30 min去 除细胞内的RNA；PBS洗涤3次，再加入3 ttg／mI。PI 标记细胞核。PBS洗涤3次，上镜观察。 2．2上镜检测 2．2．1仪器的开机与调试 本实验室的仪器为Leica TCS SP2型。开机前先 检查仪器的各开关，使之均处于关闭状态，然后接通总 稳压器电源开关；分别打开操作台工作站、电脑主机、 显示器和显微镜电源，启动激光共聚焦显微镜。本仪 器有3个激光管电源，按使用时的需要用钥匙开启。 双击“Leica Control Software”图标，进入TCS—User 界面，仪器进入自检状态；将样品反转置于显微镜上：， 调节焦距，使目的区域在视野中央。本教学实验采用 2个通道进行检测，其中第l通道激发光波长为488 nm，所对应的检测器为PMTl，用于检测GFP(green fluorescent protein)发出的绿色荧光，伪色彩采用绿 色；第2通道激发光波长为543 am，所对应的检测器 为PMT2，用于检测PI发出的红色荧光，伪色彩采用 红色。 2．2．2样本的检测与图像的采集 在镜下找到待扫描的视野，采用“Micrtrol”命令 将仪器转换到扫描模式；设置扫描方式、扫描阵列数、 扫描速度等参数；先预扫描样品，调节pinhole、PMT、 zoom、offset等旋钮， |
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